Die „Sequencing-by-Synthesis“-Methode, auch als Solexa-Illumina-Methode bekannt, ist das am weitesten verbreitete Next-Generation-Sequencing (NGS) Verfahren zur Genanalyse. Es wurde unter anderem auch genutzt, um den RNA-Fingerabdruck des SARS-CoV-2-Virus im Januar 2020 an einem Forschungsinstitut in Wuhan zu identifizieren. Seitdem wird diese Analyse des RNA-Fingerabdrucks von SARS-CoV-2 in Forschungsinstituten auf der ganzen Welt täglich wiederholt, um das Virus kontinuierlich auf Mutationen zu überwachen. Bei der Sequencing-by-Synthesis Methode spielen Subsysteme zur Bewegung und Positionierung der bildgebenden Optik und der Durchflusszellen eine entscheidende Rolle.
Optisches Scannen in X, Y und Z
Die Sequencing-by-Synthesis-Methode basiert auf einer sehr präzisen und schnellen XYZ-optischen Bildabtastung des gesamten Probenbereichs, in diesem Fall mehrkanalige Flowzellen.
Zunächst wird das gesamte zu analysierende Genom durch die Shotgun-Technik in viele kürzere Stücke zerlegt. Diese Stücke werden dann PCR-amplifiziert (Polymerase Chain Reaction, Polymerase-Kettenreaktion) und in Einzelstränge (Oligo-Stränge) aufgeteilt, bevor sie am Boden der Kanäle von sogenannten Flowzellen befestigt werden. Durch Spülen der Flowzellen mit den einzelnen Basen beginnt nun die schrittweise, vertikale Rekombination der Basenpaare. Jede Rekombination wird durch ein Fluoreszenzsignal angezeigt. Die Basenpaare enthalten vier verschiedene Nukleotide, um vier verschiedene Fluoreszenzfarben zu ergeben.
Um Turbulenzen zu reduzieren und laminare Strömungen bei den Spül- und anschließenden Waschzyklen zu erzielen, werden Flowzellen mit mehreren parallelen Kanälen verwendet. Die typische Kanalbreite beträgt einige Millimeter. Dieses mikrofluidische Pumpen und Saugen kann durch piezo-basierte Aktuatoren beispielsweise in Form von Membranpumpenplatten, Biegeaktoren oder Miniaturröhrchen schnell, präzise und zuverlässig durchgeführt werden.
Nach jeder Nukleotidspülung muss das Auslesen der gesamten Flowzelle durch einen XY-Scan mit allen vier, die Fluoreszenz anregenden Wellenlängen erfolgen. Zu diesem Zweck wird eine schnelle und präzise Positionierung der Laserquelle (für die Anregung) und des Auslesekopfs, typischerweise ein Mikroskopobjektiv, benötigt. Dies erfordert nicht nur schnelle und präzise Bewegung in XY sondern, da die Rekombination entlang der einzelnen Oligo-strands in vertikaler Richtung erfolgt auch das jeweilige Z-Niveau exakte eingestellt werden.
Dies führt zu einem zweidimensionalen Fluoreszenzdatensatz nach jedem Spül- und Waschzyklus. Jedes Fluoreszenzsignal repräsentiert ein Nukleotid in einem rekombinierten Basenpaar.
Bewegungslösungen von PI
Für das Scannen der Flowzellen in X, Y und Z sind mehrere lineare Antriebe nötig und üblicherweise wird noch ein Rotationsantrieb eingesetzt um die Flowzelle nach einem Austausch wieder exakt zu positionieren.
Piezo Aktoren von PI
Piezoaktoren arbeiten mit Frequenzen von bis zu mehreren kHz und sind ideal für Milli-, Mikro- und Nanodispensing-Anwendungen geeignet: Sie können Ventile direkt schalten, gegen eine Schließfeder oder ein flexibles Rohr zur Volumenverdrängung arbeiten und Flüssigkeiten innerhalb eines mikrofluidischen Reaktionsvolumens wie eine Membranpumpe fördern.
