Flamingo Lichtblattmikroskopie

Image courtesy: Morgridge Institute for Research – Huisken Lab

Pristina Leidyi — Erwachsener Wurm (Pristina leidyi) abgebildet mit dem Flamingo #2. Probe von Duygu Özpolat, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, Massachussets, USA

Bei der Lichtblattmikroskopie, englisch „Light Sheet Fluorescence Microscopy“ (LSFM) oder Single Plane Illumination Microscopy (SPIM) werden Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlengang auf zwei Optiksysteme verteilt, die einen Winkel von 90° zueinander bilden. Der Laserstrahl zur Probenbeleuchtung wird in eine Ebene aufgefächert und bildet einen optischen Schnitt, der eine dünne Schicht innerhalb der Probe ausleuchtet. Das dort emittierte Fluoreszenzlicht wird vom Objektiv erfasst und detektiert.

Das grundlegende Prinzip der Lichtblattmikroskopie

Die Trennung von Beleuchtung und Beobachtung bringt zwei entscheidende Vorteile mit sich:

Sie ermöglicht es, das Mikroskop quasi „um das Experiment herum“ aufzubauen. Anstatt Proben zwischen Objektträger und Deckglas „einzuzwängen“, werden sie in ein Hydrogel eingebettet und in eine zylindrische Probenkammer im Innern des Mikroskops eingebracht. Dort sind die physiologischen Bedingungen nahe an den natürlichen Gegebenheiten und ermöglichen auch Dauerexperimente mit lebenden Proben.
Bei der LSFM ist die Lichtbelastung der Proben sehr gering, was phototoxische Effekte erheblich reduziert. Erst dadurch werden Langzeitexperimente möglich.

L-505 kompakter Lineartisch mit gefaltetem Antrieb — L-505 kompakter Lineartisch mit gefaltetem Antrieb (links)

Das selbst entwickelte Funktionsprinzip von Ultraschall-Piezomotoren basiert auf einer eigenen Piezoproduktion und hat sich bei den Kunden von PI bestens bewährt. — Das selbst entwickelte Funktionsprinzip von Ultraschall-Piezomotoren basiert auf einer eigenen Piezoproduktion und hat sich bei den Kunden von PI bestens bewährt. Es ermöglicht sehr kurze Reaktionszeiten sowie eine hochgenaue Positionierung

Eine der häufigsten Anwendungen in der Lichtblattmikroskopie ist die Erstellung von Z-Stacks, mittels denen die Probe in ihrer Gänze dreidimensional dargestellt werden kann. Hierfür wird die gesamte Probenkammer in Z-Richtung, also entlang der optischen Achse des Objektivs, bewegt. In den Flamingo Lichtblattmikroskop des >> Huisken Lab an der Georg-August-Universität Göttingen steuert PI für diese Aufgabe kompakte Lineartische bei. Diese sehr kompakten Lineartische verfügen über einen gefalteten Antriebsstrang, Gleichstrommotoren mit Getriebe und Linearencodern und bieten einen Verfahrweg von 26 mm bei einer bidirektionalen Wiederholgenauigkeit von ± 250 nm. Der Tisch zeichnet sich zudem durch eine hohe Steifigkeit und Führungsgenauigkeit durch Kugelführungen aus.

Neben der Bewegung in Z-Richtung wird die Probe oftmals auch gedreht. Das dient mehreren Zwecken. Häufig wollen Forscher ihre Probe aus dem richtigen Winkel (Seitenansicht, Draufsicht usw.) oder ein Organ abbilden, das, wie das Herz, nur aus bestimmten Winkeln sichtbar ist. Die andere große Anwendung für die Rotation ist die so genannte Multiview-Bildgebung. Dabei werden Z-Stapel aus mehreren Winkeln aufgezeichnet (z.B. aus 6 Winkeln, die zusammen 360 Grad abdecken). Anschließend werden die nützlichen Teile jedes Datensatzes zu einem 3D-Bild verschmolzen, das die gesamte Probe umfasst. Dies ist besonders bei größeren Proben hilfreich, da die Probe selbst das Licht streut, bricht und absorbiert, worunter die Beleuchtungs- und Detektionsqualität von tief im Innern der Probe liegenden Strukturen leidet. Daher sind mehrere Winkel erforderlich, um alle Details zu erfassen.

Für die Rotation der Probe wird in den Flamingo LSFM Systemen der piezoelektrisch angetriebene Ultraschall-Drehtisch U-628 eingesetzt. Es bietet eine schnelle Bewegung von bis zu 720°/s bei einer Mindestschrittgröße von 51 µrad und einer bidirektionalen Reproduzierbarkeit von ±102 µrad.

The Flamingo Microscopy Project: Interview with Prof. Jan Huisken — Professor Dr. Jan Huisken, Humboldt Professor of Multiscale Biology, Georg-August-Universität Göttingen, erklärt die Technologie und Philosophie des Flamingo Lichtblattmikroskops und wie die Kooperation mit PI zustande kam

Eine Besonderheit des Konzeptes für die Flamingo Lichtblattmikroskope liegt darin, dass diese als kompakter Bausatz zu den Anwendern versandt werden. Für die Umsetzung galt es, das System sehr kompakt und robust aufzubauen. Die Lösung: ein modulares, unkompliziertes Design, mit bewährten Standardkomponenten, und kleiner Grundfläche. Das ermöglicht auch unterschiedliche, applikationsspezifische Designs: Neben der L‑SPIM Bauweise, in der Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlengang senkrecht zueinander stehen, wird in der T‑SPIM Bauweise die Probenbeleuchtung auf zwei gegenüberliegende Optiken aufgeteilt, für eine gleichmäßigere Ausleuchtung. Wird auch die Beobachtung auf zwei Strahlengänge verteilt, entsteht das X‑SPIM Modell des Mikroskops.

Das Flamingo Lichtblattmikroskop und das Flamingo Projekt ist eine Initiative von Prof. Dr. Jan Huisken und seiner Arbeitsgruppe am >> Morgridge Institute for Research. PI ist einer der Sponsoren des Flamingo Projektes.

Lesen Sie mehr auch in unserem >> Blogbeitrag.

Modulares Konzept von Flamingo: Die Lineartisch- und Drehtischmodule von PI sind rechts abgebildet — Modulares Konzept von Flamingo: Die Lineartisch- und Drehtischmodule von PI sind rechts abgebildet (Bild: Morgridge Institute for Research, Madison, WI)

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